蛋白質(zhì)與DNA互作是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵
更新時間:2021-12-28 點擊次數(shù):1469次
蛋白質(zhì)與DNA互作是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵,也是啟動基因轉(zhuǎn)錄的前提。蛋白質(zhì)與DNA互作主要包括組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、DNA甲基化酶和染色質(zhì)重塑復合物等。為了研究蛋白質(zhì)-DNA互作,科學家發(fā)明了很多方法:凝膠阻滯、DNaseⅠ足跡實驗、甲基化干擾、體內(nèi)足跡、酵母雜交、ChIP-Seq等。其中ChIP-Seq可以真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白,是目前研究蛋白質(zhì)-DNA互作的經(jīng)典方法。但該技術(shù)需要大量細胞,且步驟繁瑣,耗時較長,因此,研究者不斷在尋找新的替代方法。
DNA競爭實驗(DNAcompetitiveassay)的具體做法如下:
在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)體系中加入了超量的非標記的競爭DNA(competitorDNA),如果它同探針DNA結(jié)合的是同一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì),那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的,這樣絕大部分轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)都會被競爭結(jié)合掉,而使探針DNA仍然處于自由的非結(jié)合狀態(tài),可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現(xiàn)阻滯的條帶;
如果反應(yīng)體系中加入的競爭DNA并不能同探針DNA競爭結(jié)合同一種轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現(xiàn)阻滯的條帶。
6、應(yīng)用:
a、凝膠阻滯實驗可以用于鑒定在特殊類型細胞蛋白質(zhì)提取物中,是否存在能同某一特定的DNA(含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì);
b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)同DNA結(jié)合的精確序列部位;
c、通過競爭DNA中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的堿基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作用的影響;
d、也可以利用DNA同特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合作用通過親和層析來分離特定的轉(zhuǎn)錄因子。